淺談質(zhì)粒載體的構(gòu)建及類型

一、質(zhì)粒載體必須具備的基本條件

   現(xiàn)行通用的基因克隆載體，絕大多數(shù)就是以質(zhì)粒為基礎(chǔ)改建而成的。一般說(shuō)來(lái)，一種理想的用作克隆載體的質(zhì)粒必須滿足如下幾個(gè)方面的條件：
（1）具有復(fù)制起點(diǎn)

（2）具有抗菌素抗生基因

（3）具若干限制酶單一識(shí)別位點(diǎn)

（4）具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù) 

二、質(zhì)粒載體的選擇記號(hào)

　　在基因克隆中采用的質(zhì)粒載體的選擇記號(hào)，包括有新陳代謝特性、對(duì)大腸桿菌素E1的免疫性，以及抗菌素抗性等多種。但絕大多靈敏的質(zhì)粒載體都是使用抗菌素抗性記號(hào)。基因克隆實(shí)驗(yàn)中常用的幾種抗菌素的作用方式及其抗性機(jī)理列于。

三、不同類型的質(zhì)粒載體

　（1）高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體
　　適于分離大量的高純度的克隆基因的DNA段。如ColE1、pMB1或它們的派生質(zhì)粒。它們不僅具有低分子量、高拷貝數(shù)的優(yōu)點(diǎn)，而且在沒(méi)有蛋白質(zhì)合成的條件下仍能繼續(xù)復(fù)制。因此，若在處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)晚期的含有ColE1一類質(zhì)粒的大腸桿菌培養(yǎng)物中，加入適量的蛋白質(zhì)合成抑制劑講如氯霉素或壯觀霉素處理之后，每個(gè)細(xì)胞中的質(zhì)粒拷貝數(shù)則可擴(kuò)增到1000～3000個(gè)之多。如果加入高濃度的尿核苷，質(zhì)粒DNA又可進(jìn)一步擴(kuò)增2～3倍。


　（2）低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體
　　適合于克隆含量過(guò)高對(duì)寄主代謝有害的DNA。例如，pLG338、pLG339及pHSG415。這類質(zhì)粒載體的一個(gè)普遍性問(wèn)題是，由于它們體積小、拷貝數(shù)低，與此相應(yīng)的基因劑量也就較少，因此要制備大量的克隆DNA就很困難。


　（3）失控的質(zhì)粒載體
　　失控的質(zhì)粒載體（runaway plasmid vectors）：是一些低拷貝的質(zhì)粒，其復(fù)制控制是溫度敏感型的，也就是說(shuō)在不同的溫度下，拷貝數(shù)會(huì)有顯著的變化。
　　B.E.Uhlin等人（1979）首先發(fā)展了失控的質(zhì)粒載體pBEU1和Pbeu2。這種質(zhì)粒載體在30℃下，每個(gè)寄主細(xì)胞中只含有適量的拷貝數(shù)，而當(dāng)培養(yǎng)溫度超過(guò)35℃時(shí)，質(zhì)粒的復(fù)制便失去了控制，每個(gè)細(xì)胞中的拷貝數(shù)便持續(xù)上升。在這種高溫環(huán)境下，細(xì)胞的生長(zhǎng)蛋白質(zhì)的合成可按正常的速率持續(xù)2～3小時(shí)。這期間編碼在質(zhì)粒載體上的基因產(chǎn)物便超過(guò)了常量。zui后，細(xì)胞生長(zhǎng)受到了抑制，并失去了存活的能力，但在這個(gè)階段質(zhì)粒DNA可累積到占細(xì)胞總DNA的50%。


　（4）插入失活型的質(zhì)粒載體
　　選用插入失活型質(zhì)粒，將外源DNA段插入在會(huì)導(dǎo)致選擇記號(hào)基因（如tetr、ampr、cmlr等）失活的位點(diǎn)，就有可能通過(guò)抗菌素抗性的篩選，大幅度地提高獲得陽(yáng)性克隆的幾率。除了pDF471和Pdf42之外，都具有基因插入失活的克隆位點(diǎn)，因此都屬于插入失活型的質(zhì)粒載體。


　（5）正選擇的質(zhì)粒載體
　　正選擇質(zhì)粒載體（direct selection vectors）：這種質(zhì)粒載體具有具有直接選擇記號(hào)并賦予寄主細(xì)胞相應(yīng)的表型。通過(guò)選擇具這種表型特征的轉(zhuǎn)化子，便可大大降低需要篩選的轉(zhuǎn)化子的數(shù)量，從而減輕了實(shí)驗(yàn)的工作量，提高了選擇的敏感性。


　（6）表達(dá)型的質(zhì)粒載體
　　使克隆在大腸桿菌中特定位點(diǎn)的外源真核基因的編碼序列置于大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄-轉(zhuǎn)譯信號(hào)控制之下，并能在大腸桿菌細(xì)胞中正常轉(zhuǎn)錄并轉(zhuǎn)譯成相應(yīng)蛋白質(zhì)的克隆載體特稱為表達(dá)載體（expression vectors）。它分為表達(dá)型質(zhì)粒載體和表達(dá)型噬菌體載體兩種不同的類型。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　      一種典型的大腸桿菌表達(dá)型質(zhì)粒載體的主要組成部分，包括大腸桿菌的啟動(dòng)子及操縱全點(diǎn)序列、多克隆位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)譯信號(hào)、質(zhì)粒載體的復(fù)制起點(diǎn)及抗菌素抗性基因

     那些沒(méi)有經(jīng)過(guò)以基因克隆為目標(biāo)的體外修飾改造的質(zhì)粒被成為天然質(zhì)粒。在大腸桿菌中，常見(jiàn)的要用于基因克隆的天然質(zhì)粒有ColE1RSF2124和pSC101等。
　　鑒于天然質(zhì)粒用作基因克隆載體存在著不同程度的局限性，所以科學(xué)工作者便在其基礎(chǔ)上進(jìn)行了修飾改造，首先發(fā)展出了一批低分子量、高拷貝、多選擇記號(hào)的質(zhì)粒載體。