第六章 蛋白轉膜

                                第六章 蛋白轉膜

6.1  轉膜的定義

將電泳后分離的蛋白質從凝膠中轉移到固相載體（例如 NC 膜）上，通常有兩種方法：毛細管印跡法和電泳印跡法。常用的電泳轉移方法有濕轉和半干轉。兩者的原理*相同，只是用于固定膠/膜疊層和施加電場的機械裝置不同。前者操作容易，轉移效率高；而后者適用于大膠的蛋白轉移，所用緩沖液少。

6.2  轉移膜的選擇

    雜交膜的選擇是決定 Western blot 成敗的重要環節。應根據雜交方案、被轉移蛋白的特性以及分子大小等因素，選擇合適材質、孔徑和規格的雜交膜。用于 Western blot 的膜主要有兩種：硝酸纖維素膜（NC） 和PVDF 膜。NC 膜是蛋白印跡實驗的標準固相支持物，在低離子轉移緩沖液的環境下，大多數帶負電荷的蛋白質會與膜發生疏水作用而高親和力的結合在一起，但在非離子型的去污劑作用下，結合的蛋白還可以被洗脫下來。根據被轉移的蛋白分子量大小，選擇不同孔徑的 NC 膜。因為隨著膜孔徑的不斷減小，膜對低分子量蛋白的結合就越牢固。通常用 0.45 μm 和 0.2 μm 兩種規格的 NC 膜。大于 20 kD 的蛋白可用 0.45 μm 的膜，小于 20 kD 的蛋白就要用 0.2 μm 的膜了，如用 0.45 μm 的膜就會發生“Blowthrough"的現象。PVDF 膜靈敏度、分辨率和蛋白親和力比常規的膜要高，非常適合于低分子量蛋白的檢測。但 PVDF 膜在使用之前必需用純甲醇浸泡飽和1-5秒鐘。

zui 常 用 于 Western Blot 的轉移膜主要是 硝 酸 纖 維 素 （ Nitrocellulose, NC ）膜和聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龍膜、DEAE 纖維素膜做蛋白印跡。尼龍膜和 NC 膜的特點相似,主要用于核酸雜交。

    硝酸纖維素（nitrocellulose, NC）膜：NC 與蛋白質靠疏水作用結合，無需預先活化，對蛋白質的活性影響小；非特異性本底顯色淺；價格低廉，使用方便。但結合在 NC 上的小分子蛋白質在洗滌時易丟失； NC韌性較差，易損壞。

    聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride, PVDF)膜：與蛋白質親和力高，用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上的正電基團，使其更容易與帶負電荷蛋白結合。

膜的選擇主要根據：

膜與目的蛋白分子的結合能力（也就是單位面積的膜能結合蛋白的載量），以及膜的孔徑（也就是攔截蛋白的大小）；

不影響后續的顯色檢測（也就是適和用于所選的顯色方法，信噪比好）；

如果后繼實驗有其他要求，比如要做蛋白測序或者質譜分析，還要根據不同目的來挑選不同的轉移膜。



                                                      

6.3  轉膜步驟（以槽式濕轉為例）

1.  將膠浸于轉移緩沖液中平衡 10 min。

注意：如檢測小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易擴散出膠。

2.  依據膠的大小剪取膜和濾紙 6 片，放入轉移緩沖液中平衡 10 min。如用 PVDF 膜需用純甲醇浸泡飽和 3-5秒鐘。

3.  裝配轉移三明治：海綿/3 層濾紙/膠/膜/3 層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕去氣泡。

    切記：膠放于負極面（黑色面）。

4.  將轉移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面對黑色面），加轉移緩沖液，插上電極，100 V，1 h（電流約為 0.3 A）。

注意：應再次檢查三明治和電極是否裝配正確，電源是否接通。


 5.  轉膜結束后，切斷電源，取出雜交膜。

                                                                        

6.4  轉膜注意事項

1. 泡膜：轉膜之前將海綿、膠、膜都用預冷的轉移 buffer 浸泡 20min；

a. 凝膠若是沒在預冷的轉膜 buffer 中浸泡，就會在轉膜過程中出現凝膠皺縮，導致出現轉移條帶變形。

b. PVDF 膜具有疏水性，需用甲醇浸泡。

2. 轉膜順序：陰極碳板+海綿+三濾+膠+膜+三濾+海綿+陽極碳板；

3. 轉膜條件：0.35 A/250 V/1 h/40 min/冰浴中進行轉膜（轉膜過程產生大量的熱，注意冷卻）；

（具體轉膜時間要根據目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越大，需要的轉膜時間越長，反之則短。）

4. 其它注意事項：

a. 避免直接用手碰雜交膜，使用鑷子。因為手上的蛋白和油脂會影響轉膜效率并會使膜臟掉。

b. 夾好膜和凝膠后，確定在凝膠/膜和濾紙之間沒有氣泡存在，否則會導致轉膜不*。

c. 保證膜和濾紙的大小和凝膠*一樣，過大和過小都會影響轉膜效率。

                      d. 雞來源的抗體與 PVDF 和尼龍膜有較強的結合能力，從而產生較高的背景，故如果選擇雞來源的抗體

6.5  轉膜后檢測（此步可以省略）

   轉膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預先準備好的 TBST（或 PBST）中漂洗 1-2 分鐘，以洗去膜上的轉膜液。轉膜的效果可以觀察所使用的預染蛋白質分子量標準，通常分子量zui大的 1-2 條帶較難全部轉到膜上。轉膜的效果也可以用麗春紅染色液或硬度墨汁染色液對膜進行染色，以觀察實際的轉膜效果。也可以用考馬斯亮藍快速染色液對完成轉膜的 SDS-PAGE 膠進行染色，以觀察蛋白的殘留情況。

a. 麗春紅染色：蛋白帶出現后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖維素濾膜，換水幾次。

b. 印度墨汁染色：只用于放射性標記抗體或放射性標記 A 蛋白探針的 Western 印跡過程。

印度墨汁不能和化學發光物合用，若是使用呈色反應的酶檢測法時，印度墨汁的黑色會使凝膠難于拍照。這時，可改用其他檢測方法或換用麗春紅 S。

注意：從轉膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產生較高的背景。